糖尿病难愈创面应用小剂量胰岛素：上皮化、纤维化及血管新生

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.20.006

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (20): 3650-3657.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.20.006

• 皮肤粘膜组织构建 skin and mucosal tissue construction • 上一篇下一篇

糖尿病难愈创面应用小剂量胰岛素：上皮化、纤维化及血管新生

王芳¹，栗勇¹，苏映军¹，王钠¹，徐晨¹，周博²

1解放军第四军医大学第一附属医院整形外科，陕西省西安市 710032
2解放军第四军医大学临床医学系，陕西省西安市 710032

收稿日期:2013-02-23 修回日期:2013-03-07 出版日期:2013-05-14 发布日期:2013-05-14
通讯作者: 栗勇，博士，副教授，副主任医师，解放军第四军医大学第一附属医院整形外科，陕西省西安市 710032 dr.liyong@yahoo.com.cn
作者简介:王芳★，女，1987年生，贵州省仁怀市人，汉族，解放军第四军医大学第一附属医院整形外科在读硕士，主要从事创面愈合方面的研究。 wangfang1956@163.com
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(30771114)。

Application of low-dose insulin in diabetes refractory wound healing: Epithelialization, collagen deposition and angiogenesis

Wang Fang¹, Li Yong¹, Su Ying-jun¹, Wang Na¹, Xu Chen¹, Zhou Bo²

1 Department of Plastic Surgery, Xijing Hospital, the First Affiliated Hospital of Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China
2 Department of Clinical Medicine, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China

Received:2013-02-23 Revised:2013-03-07 Online:2013-05-14 Published:2013-05-14
Contact: Li Yong, M.D., Associate professor, Associate chief physician, Department of Plastic Surgery, Xijing Hospital, the First Affiliated Hospital of Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China dr.liyong@yahoo.com.cn
About author:Wang Fang★, Studying for master’s degree, Department of Plastic Surgery, Xijing Hospital, the First Affiliated Hospital of Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China wangfang1956@163.com
Supported by:
General Program of National Natural Science Foundation of China, No. 30771114

摘要/Abstract

摘要：

背景：糖尿病会影响正常创面愈合过程而形成难愈性创面。
目的：观察局部应用小剂量胰岛素对糖尿病难愈性创面愈合的作用。
方法：将大鼠随机分为实验组与对照组，对照组喂予普通饲料，实验组采用高糖高脂饲料结合小剂量链脲佐菌素诱导大鼠糖尿病模型。随后在各组大鼠背部建立创面，对照组大鼠不予处理，实验组随机等分为模型组、凡士林组和胰岛素组，后2组分别以凡士林和小剂量胰岛素涂抹创面。
结果与结论：实验组大鼠糖尿病诱导成功率几乎100%；模型组、凡士林组和胰岛素组大鼠创面完全上皮化时间均较对照组明显延长(P < 0.05)；且与模型组和凡士林组相比，胰岛素组大鼠创面愈合率显著升高，上皮化程度高，并且胶原纤维密度增加，排列较为规整，血管化程度增加。说明局部应用小剂量胰岛素可以促进上皮化、纤维化及血管新生，从而加速糖尿病创面的愈合速度。

关键词: 组织构建, 皮肤组织构建, 糖尿病, 难愈性创面, 创面愈合, 高糖高脂饮食, 小剂量胰岛素, 凡士林, 链脲佐菌素, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Diabetes can influence the normal course of wound healing, thus leading to refractory wound.
OBJECTIVE: To observe the effects of topical application of low-dose insulin on diabetes refractory wound healing.
METHODS: Rats were randomly divided into experimental group and control group: rats in the control group were fed with regular diet and those in the experimental group were fed with high-carbohydrates-fat diet. Rats in the experimental group received intraperitoneal injection of streptozotocin to induce diabetic models. Wounds were made on the back of the rats. The rats in the control group received no treatment, while rats in the experimental group were divided into model group, Vaseline group and insulin group. Wounds in the Vaseline group and insulin group were treated with Vaseline and a small dose of insulin, respectively.
RESULTS AND CONCLUTION: The success rate of induction for diabetes in the experimental group was almost 100%. Complete epithelialization time of the wounds in the model group, Vaseline group and insulin group was longer that than that in the control group (P < 0.05). Compared with the model group and the Vaseline group, the wound healing rate of rats in the insulin group was increased significantly with higher epithelialization degree, the density of collagen fibers was increased and arranged in regular, and the degree of vascularization was increased. The results indicate that topical application of low dose insulin can promote the epithelialization, collagen deposition and angiogenesis, thus accelerating diabetic wound healing.

Key words: tissue construction, skin tissue construction, diabetes, refractory wound, wound healing, high-carbohydrates-fat diet, low dose of insulin, Vaseline, streptozotocin, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

R318

王芳，栗勇，苏映军，王钠，徐晨，周博. 糖尿病难愈创面应用小剂量胰岛素：上皮化、纤维化及血管新生[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(20): 3650-3657.

Wang Fang, Li Yong, Su Ying-jun, Wang Na, Xu Chen, Zhou Bo. Application of low-dose insulin in diabetes refractory wound healing: Epithelialization, collagen deposition and angiogenesis [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(20): 3650-3657.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析 入组实验动物60只，除实验需要处死动物外，无异常死亡及脱失动物，直至实验结束。

2.2 糖尿病大鼠大体状况 对照组大鼠生长状况较好，体质量呈持续增加，毛发有光泽，无其他特殊症状。实验组大鼠在未注射链脲佐菌素前体质量增长较快，注射链脲佐菌素后体质量渐渐下降，毛色逐渐干枯发黄，并出现多饮、多食、多尿等症状。2组大鼠体质量变化差异有显著性意义(P < 0.05)，见图1。

2.3 糖尿病大鼠的空腹血糖、空腹胰岛素水平、胰岛素抵抗指数和胰岛素敏感指数的变化 链脲佐菌素注射后，实验组大鼠空腹血糖水平高于对照组。创面使用小剂量胰岛素后，实验组大鼠空腹血糖水平未见明显改变(P > 0.05)，见图2。

空腹血糖、空腹胰岛素水平和胰岛素抵抗指数升高，胰岛素敏感指数降低(P < 0.05)，见表1。

2.4 胰岛素对糖尿病大鼠创面愈合时间和创面愈合率的影响 模型组、凡士林组和胰岛素组大鼠创面完全上皮化时间分别为(35.5±0.9)，(31.4±1.2)和(25.3±1.8) d，均较对照组明显延长[(16.4±1.5) d；P < 0.05]；且伤后第3天起胰岛素处理的大鼠创面愈合率显著高于模型组和凡士林组(P < 0.05)，其中以第12天最为明显；与对照组相比，模型组、凡士林组和胰岛素组大鼠创面愈合时间创面愈合率均降低(P < 0.05)，见图3。

2.5 胰岛素对糖尿病大鼠创面组织形态的影响 苏木精-伊红染色显示，创面建立第3天，糖尿病大鼠创面组织均可见大量炎性细胞浸润，以中性粒细胞为主，毛细血管部分扩张；9 d时，模型组、凡士林组仍见明显中性细胞浸润，可见少量淋巴细胞，胰岛素组炎性细胞较模型组和凡士林组少，可见少量成纤维细胞，可见部分基底细胞增生；15 d时，各组大鼠可见部分新生上皮组织，模型组新生表皮较薄弱未见所有表皮层，组织中仍有较多中性粒细胞和淋巴细胞，凡士林组炎性细胞数量减少，新生表皮较凡士林组增厚，胰岛素组创面愈合质量较好，可见基底细胞增生并向棘细胞分化，新生表皮结构较为完整，表皮与真皮附着，附着处可见钉突，并可见部分新生血管，炎性细胞浸润数量较少，见图4，5。

Masson染色显示，创面建立第3天，模型组、凡士林组和胰岛素组大鼠背部创面胶原纤维排列较紊乱、疏松；第9天时，模型组胶原纤维排列仍较稀疏紊乱，凡士林组胶原纤维密度有所增加，但排列极不规整，胰岛素组胶原纤维密度明显增加，排列相对规整；第15天时，各组胶原纤维密度均明显增加，但模型组仍疏松，C组较模型组、凡士林组规整致密，见图6。

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引言

创面愈合是一个复杂的生物学过程，是炎性细胞、修复细胞、细胞外基质及细胞因子等多因素共同参与并高度协调、相互调控的复杂过程。正常创面愈合过程可大致分为3个阶段：局部炎症反应阶段、细胞增殖分化阶段和组织塑形重建阶段。但在某些因素如糖尿病等的作用下，这种有序的过程被破坏，导致慢性难愈性创面的发生^[1]。慢性难愈性创面目前尚无明确定义，通常可以理解为在各种内在或外界因素作用下创面不能通过正常的创面愈合进程达到愈合，进入一种病理性炎症反应状态，从而导致创面经久难愈。造成此种破坏的因素归纳起来主要有以下5点：①营养不良。②组织灌注不良和缺血再灌注损伤。③细菌负荷、感染和坏死组织存留。④糖尿病。⑤细胞衰老^[2]。在上述因素的影响下，创面修复能力被削弱，而以损伤因素为主导，最终导致了慢性难愈创面的形成。

糖尿病患者皮肤易受损伤，损伤后创面愈合延迟或不愈合，是临床上亟待解决的难点^[3]。美国每年在慢性糖尿病创面愈合治疗方面的费用已超过250亿^[4]。而中国作为糖尿病患者第一大国，住院糖尿病患者的糖尿病足发病率为1.6%-6.4%，城市治疗2型糖尿病及其并发症的年直接医疗费用也高达187.5亿元，占卫生总费用的3.94%。随着人口老龄化、糖尿病和肥胖等发生率的提高，糖尿病创面的发生率及治疗费用也在迅速增加，这将发展为严重的社会问题^[5]。糖尿病创面愈合延迟原因尚不清楚，可能是众多因素共同作用的结果，但具体机制不清。国内外学者研究结果表明糖尿病创面难于愈合的可能原因包括生长因子产生减少，巨噬细胞功能受损，胶原沉积受阻，角质形成细胞和成纤维细胞迁移及增殖受损等^[6]。因此，探索糖尿病创面愈合的机制以及寻求一种高效经济的治疗药物迫在眉睫。

胰岛素是人体内不可缺少的内分泌激素，由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素^[7]。胰岛素是机体内惟一降低血糖的激素，同时还能促进糖原、脂肪、蛋白质合成。临床上外源性的胰岛素主要用于糖尿病的治疗^[8]。胰岛素相对或绝对缺乏是糖尿病的特点之一，有研究表明皮肤中胰岛素及其生物学行为受损是糖尿病创面愈合延迟的重要原因之一^[9-13]。近年来国内外诸多学者将胰岛素系统的作用于烫伤等动物模型创面，发现胰岛素在治疗烧伤方面具有积极意义，在调控血糖、缓解炎症反应及抗蛋白分解等方面也能发挥了作用，使创面愈合时间明显缩短，愈合速度加快，但是具体机制不清^[14-15]。实验拟通过高糖高脂饲料加上小剂量链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型并建立大鼠背部难愈性创面模型，局部使用小剂量胰岛素观察其对难愈性创面愈合的影响，并探讨其可能的作用机制，为慢性难愈性创面愈合的治疗提供新的思路。

材料方法

设计：对比观察动物学实验。

时间及地点：于2011年10月至2012年12月在解放军第四军医大学西京医院全军整形外科研究所重点实验室和解放军第四军医大学病理和病理生理学实验室完成。

材料：

实验动物：健康清洁级4周龄SD雄性幼鼠60只，体质量80-100 g，皮肤无损伤，由解放军第四军医大学动物中心提供，生产许可证号：SCXK(军)2007-007，随机每笼饲养5只，自由饮食饮水，光照周期12 h/12 h，实验符合动物伦理学要求。

动物饲料：高糖高脂饲料由黑龙江省六和饲料厂提供，以质量计算，饲料配方为：基础饲料55%，脂肪10%，胆固醇10%，糖20%，奶粉5%，另加少量微量元素。糖、奶粉、及微量元素需在短时间内食用，否则将导致饲料变质。因此每2周配制饲料1次，配制时新加入糖、奶粉及微量元素。普通饲料由第四军医大学动物中心提供，其中碳水化合物占质量的53%，脂肪占4%，蛋白质占18%，纤维素、微量元素、水分等占25%。

胰岛素治疗糖尿病大鼠难愈性创面愈合实验应用的主要试剂及仪器：

Main reagents and instruments:

方法：

实验动物分组及糖尿病大鼠的诱导：普通饲料适应性饲养1周后，随机将60只SD大鼠分为对照组(n=15)和实验组(n=45)。对照组大鼠继续普通饲料饲养，而实验组大鼠以高糖高脂饲料饲养，饮食均不限制。

饲养8周后，将实验组大鼠禁食不禁水过夜(约 12 h)，称质量后剪尾检测空腹血糖；以25 mg/kg、1%浓度计算出所需注射的链脲佐菌素量及柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的量，将所需链脲佐菌素溶于pH 4.4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，0.22 μm滤器过滤除菌后腹腔注射入实验组大鼠，连续注射3 d，最后1次注射后72 h检测空腹血糖，若血糖高于16.7 mmol/L即为造模成功，继续高糖高脂饲料饲养。若不成功，继续同样方法诱导直至成功^[16]。对照组大鼠腹腔注射同样体积的柠檬酸+柠檬酸钠缓冲液。

空腹血糖及空腹血清胰岛素水平的检测及胰岛素敏感指数和胰岛素抵抗指数的计算：将饥饿过夜的SD大鼠麻醉后剪尾取血，每次取血约500 μL，室温静置30 min后，室温3 000 r/min，离心20 min，小心吸取上清，标记后冻存于-80 ℃冰箱，检测时若标本中出现沉淀，再次离心去除。空腹血糖分别于链脲佐菌素注射前、链脲佐菌素注射72 h后、造模成功后每3 d检测；空腹血清胰岛素的检测参照试剂盒说明书，采用ELSIA方法按照ELISA 定量检测：抗原包被→封闭→待检标本→生物素化抗体→洗涤→酶标记亲和素→洗涤→加底物显色和检测步骤进行操作。胰岛素敏感指数及胰岛素抵抗指数的计算参照稳态模型胰岛素抵抗指数和胰岛素敏感指数计算公式。

糖尿病大鼠背部创面模型的构建：在链脲佐菌素诱导成功后4周，以0.04 mL/kg浓度腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，硫化钠脱毛剂去除背部毛发，将大鼠放置于已消毒后的手术操作台，固定大鼠后碘伏及生理盐水清洗大鼠背部区域，尤其脱毛区，在大鼠背部设计2个直径为2 cm的圆形创面，去除全层皮肤包括表皮、真皮及肉膜。将直径为2.5 cm的固定环间断缝合固定于创面周围，防止创面挛缩，并于术后第10天取下固定环。建立创面后的大鼠需单笼饲养。对照组大鼠以同样方法建立背部创面。

创面处理：对照组大鼠创面不予以任何处理。实验组大鼠随机等分为模型组、凡士林组和胰岛素组，分别以无任何处理、凡士林、胰岛素软膏(自制胰岛素浓度为 5 U/kg的凡士林软膏)干预大鼠背部创面，涂抹软膏时均以能薄层覆盖整个创面为准，无敷料覆盖，创面生成后立即开始使用，1次/d，直至创面愈合。

大体情况观察：每天观察大鼠一般情况包括体质量变化、精神状态、毛发、饮水量、食量及尿便等。

创面愈合观察：观察各组创面闭合情况，记录创面愈合时间，即创面模型建立至创面完全上皮化、闭合的时间。每天对创面进行拍照，同时以透明薄膜临摹创缘，然后通过电脑设计的方格计算出创面面积，按照下面的公式计算创面愈合率。

创面组织学形态观察：创面建立后第3，9，15天麻醉大鼠，取创面及周围2 mm组织，体积分数10%甲醛固定，常规石蜡包埋，连续切片，厚4 μm；切片分别行苏木精-伊红染色和Masson染色。

苏木精-伊红染色方法：切片脱蜡后由高浓度乙醇到低浓度乙醇，然后如蒸馏水后放入苏木精水溶液染色数分钟后分色并冲洗，再次脱水后行乙醇伊红染色，脱水透明后封固镜下观察。

Masson染色方法：切片脱蜡至水后进行weigert铁苏木素染色，分化冲洗后用丽春红酸性品红染液染色后磷泪酸溶液处理，苯胺蓝复染后脱水透明，封固后镜下观察。

主要观察指标：苏木精-伊红染色观察糖尿病大鼠创面组织上皮化程度、炎性细胞浸润情况、创面内新生血管形成等状况；Masson染色观察糖尿病大鼠创面组织胶原纤维密度、分布等情况。

统计学分析：计量资料以x(_)±s表示，结果采用SPSS公司的SPSS 16.0统计软件处理，两组间、组内比较进行t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

链脲佐菌素作为DNA烷基化试剂，是从链霉菌中提取出来的抗生素，由葡萄糖分子和甲基化氮源部分组成，是诱导糖尿病动物模型的常用药物之一^[17]。这是因为链脲佐菌素能通过葡萄糖转运蛋白2抗体独自进入细胞，特异性的作用于胰岛β细胞并引起其结构破坏和胰岛素分泌功能障碍^[14]。链脲佐菌素诱导大鼠的糖尿病模型在国内外研究均有报道, 但研究表明链脲佐菌素诱导糖尿病的发生及类型取决于鼠的种属、性别、用药剂量计用药次数^[18-20]。实验通过给予大鼠高糖高脂饲料饲养，可使其外周组织对于胰岛素敏感性降低，然后再给予小剂量链脲佐菌素注射，使部分胰岛β细胞功能遭到破坏，诱导高血糖发生；长期高血糖通过一系列反应能够降低胰岛素的敏感性，导致胰岛素抵抗的发生，从而诱导出病理、生理改变均接近于2型糖尿病的动物模型^[21]。2型糖尿病的发病原因之一是组织对胰岛素敏感性低，出现胰岛素抵抗这是2型糖尿病的发病基础。目前认为：稳态模型胰岛素抵抗指数和胰岛素敏感指数是2种简单、能较准确评价胰岛素抵抗的方法，适用于临床常规检测胰岛素抵抗。稳态模型胰岛素抵抗指数是空腹基础状态下胰岛β细胞功能的有效评价指标，用来描述胰岛素抵抗的程度，与胰岛素敏感性负相关；胰岛素敏感指数是指胰岛素作用的靶器官对胰岛素作用的敏感性下降，即正常剂量的胰岛素产生低于正常生物学效应的一种状态。反映机体外周胰岛素靶组织对胰岛素的敏感程度，可评价机体胰岛素抵抗程度，该计算法与胰岛素钳夹技术高度相关^[22]。

实验结果发现与成年大鼠相比，给予幼鼠高糖高脂饲养，能明显提高2型糖尿病模型诱导的成功率，可能是由于幼鼠体内β细胞对链脲佐菌素敏感性以及再生力不同，导致成鼠后β细胞数量相对减少。故幼鼠时期体内即给与注射链脲佐菌素，其β细胞坏死及增生可使成鼠β细胞数量及生化特点稳定。这说明该方法稳定性好，是研究非肥胖型2型糖尿病的理想载体。高糖高脂饲料饲养时间越长(≥8周)，糖尿病模型诱导成功率越高，使用的链脲佐菌素量却可减少，说明长时间的高糖高脂饮食导致了动物外周组织对胰岛素不敏感程度增加，动物肥胖和胰岛素抵抗更加明显，胰岛素分泌功能负担加重，因此使用较小剂量的链脲佐菌素即可使其胰岛β细胞功能受损，导致糖尿病的发生；本实验结果显示链脲佐菌素注射后，大鼠血糖水平是注射前及正常对照组的3-5倍，并且将持续至11周以上；实验组血糖、血清胰岛素水平及胰岛素抵抗指数较对照组明显升高，胰岛素敏感指数较对照组明显下降，这些指标变化反映用此方法诱导糖尿病模型的稳定性较好，值得推广；同时诱导后的大鼠出现了体质量下降、多饮和多尿的等糖尿病的症状；以上研究结果表明高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型可作为2型糖尿病动物模型建立稳定和常用的方法。

有研究表明，胰岛素能够促进创面的愈合^{[12-13, 19]}。实验结果显示，在糖尿病大鼠难愈性创面，与空白组对照，小剂量的胰岛素能够在不影响全身血糖水平的状态下，显著加速创面愈合速度，单独使用凡士林对创面亦有保护作用，但作用效果不及胰岛素。创面愈合时间及创面愈合率是评估创面愈合的传统及直接指标。实验中，糖尿病创面愈合时间明显长于正常创面，创面愈合率明显低于正常创面，这与前期研究相符^[23]。预实验将0.1，0.25，0.5及1.0 U的胰岛素软膏用于正常大鼠创面，结果表明0.5和1.0 U胰岛素软膏对创面愈合的作用效果均较为明显，但1.0 U胰岛素软膏会影响血糖水平，0.5 U的胰岛素软膏不仅能够明显缩短糖尿病创面愈合时间，增加创面愈合率，而且更重要的是该剂量对糖尿病大鼠血糖水平没有影响。

组织病理学的观察是评价创面愈合的又一直接有效指标。早期研究中，Eldad等^[24]学者提出苏木精-伊红染色后观察表皮结构，真皮-表皮邻接处和微水泡，胶原束和皮肤结构，表皮再生以及粒细胞浸润数量并予以评分来评估创面愈合情况。既往有研究显示，胰岛素可通过促进胰岛素受体和PI3K-Akt-SREBP1-Racl介导内皮细胞的迁移和管腔形成，加速血管新生，提示胰岛素参与对血管生成的调控^[25]。有研究表明胰岛素作为潜在的激素调节因子，能够通过调节胰岛素样生长因子受体，刺激成纤维细胞的氨基异丁酸的转运，从而促进胶原的生成及沉积^[25-26]。在烧伤创面大鼠模型连续皮下注射胰岛素，发现创面中的胶原沉积也增多^[27]。在实验中，苏木精-伊红染色及Masson三色染色结果表明，应用小剂量的胰岛素后，糖尿病创面新生表皮厚度、表皮对真皮的附着部位及血管化程度均优于模型组及凡士林组；创面组织中未见微水泡；中性粒细胞和淋巴细胞等炎性细胞浸润程度不及凡士林及模型组，而胶原纤维排列整齐，分布较为均匀致密，说明小剂量胰岛素在创面愈合中上皮化及血管化、纤维化过程中均起到了重要的作用，从而提高了创面愈合的质量。

总之，高糖高脂饮食结合小剂量链脲佐菌素注射能够诱导稳定的2型糖尿病大鼠模型；局部应用小剂量胰岛素能够通过促进上皮化、纤维化和血管化，从而加速糖尿病难愈性创面的愈合，提高创面愈合的质量，并且对血糖无不良影响。因此，胰岛素作为临床上常用药物，安全可靠，并且价格低廉，在创面愈合领域中将是一种既经济又安全有效的难愈性创面的治疗方法，值得更深入的研究并向临床推广应用。

糖尿病难愈创面应用小剂量胰岛素：上皮化、纤维化及血管新生

Application of low-dose insulin in diabetes refractory wound healing: Epithelialization, collagen deposition and angiogenesis

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